Prevenção da Leishmaniose Canina em uma Área Hiperendêmica Utilizando uma Combinação de Imidacloprida a 10%/Flumetrina a 4,5%

Empresa

Bayer

Data de Publicação

01/03/2018

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Domenico Otranto, Filipe Dantas-Torres, Donato de Caprariis, Giancarlo Di Paola, Viviana D. Tarallo, Maria S. Latrofa, Riccardo P. Lia, Giada Annoscia, Edward B. Breitschwerdt, Cinzia Cantacessi, Gioia Capelli, Dorothee Stanneck

* E-mail: domenico.otranto@uniba.it

Resumo

Base

Os cães constituem os principais hospedeiros reservatórios de Leishmania infantum, o agente da leishmaniose visceral zoonótica humana.

Este estudo investigou a eficácia de uma coleira de matriz polimérica que continha uma combinação de imidacloprida a 10% e flumetrina a 4,5% como uma nova medida profilática para evitar infecções por L. infantum em cães jovens de uma área hiperendêmica do sul da Itália, objetivando potencializar as estratégias de controle atuais contra leishmaniose tanto humana quanto canina.

Metodologia/Principais Achados

O estudo foi realizado em 124 cães jovens, dos quais 63 tinham coleira (Grupo A), enquanto 61 foram deixados sem tratamento (Grupo B), de março-abril de 2011 a março de 2012.

Foram coletadas amostras sanguíneas e cutâneas na linha-base (abril de 2011) e no primeiro, segundo, terceiro e quarto pontos de checagem de acompanhamento (julho de 2011, setembro de 2011, novembro de 2011 e março de 2012, respectivamente).

A medula óssea e a conjuntiva foram amostradas na linha-base e no quarto acompanhamento. Testes sorológicos, citológicos e moleculares foram realizados para detectar a presença de L. infantum nos diferentes tecidos coletados

No final do estudo, nenhum cão do Grupo A testou positivamente quanto a L. infantum em nenhum acompanhamento, enquanto 22 cães do Grupo B foram infectados (taxa de densidade de incidência = 45,1%); portanto, a combinação de imidacloprida a 10% e flumetrina a 4,5% foi 100% eficaz para a prevenção de infecção por L. infantum em cães jovens antes de sua primeira exposição ao parasita em uma área hiperendêmica quanto a CanL.

Conclusões

O uso de coleiras contendo imidacloprida a 10% e flumetrina a 4,5% conferiu proteção de longa duração contra infecção por L. infantum em cães localizados em uma área hiperendêmica, consequentemente representando uma estratégia confiável e sustentável para reduzir a frequência e o alastramento da doença na população canina, o que resultará finalmente na redução dos riscos associados à saúde humana.

Citação: Otranto D, Dantas-Torres F, de Caprariis D, Di Paola G, Tarallo VD, et al. (2013) Prevention of Canine Leishmaniosis in a Hyper-Endemic Area Using a Combination of 10% Imidacloprid/4.5% Flumethrin PLoS ONE 8(2):e56374. doi:10.1371/journal.pone.0056374

Editor: Stuart Alexander Ralph, Universidade de Melbourne, Austrália

Recebido: 1 de novembro de 2012; Aceito: 8 de janeiro de 2013; Publicado: 25 de fevereiro de 2013.

Copyright: © 2013 Otranto et al. Este é um artigo de acesso aberto, distribuído sob os termos da Licença de Atribuição Creative Commons, que permite uso, distribuição e reprodução irrestritos em qualquer meio, contanto que o autor e a fonte sejam creditados.

Financiamento: Este projeto foi financiado pela Bayer Animal Health GmbH (Alemanha). Os financiadores não tiveram papel no desenho do estudo, na coleta e na análise de dados, na decisão de publicar ou na preparação do manuscrito

Interesses Conflitantes: O estudo foi apoiado pela Bayer Animal Health GmbH (Alemanha) e a Dra. Dorothee Stanneck é funcionária da Bayer Animal Health GmbH, Leverkusen, Alemanha. Não há patentes, produtos em desenvolvimento ou produtos comercializados a declarar. Isso não altera a adesão dos autores a todas as políticas da PLOS ONE sobre compartilhamento de dados e materiais, conforme detalhado online no guia para autores.

Introdução

Leishmania infantum é um parasita protozoário importante, transmitido por vetores artrópodos e que causa leishmaniose visceral e cutânea em cães e humanos em países do sul da Europa, África, Oriente Médio e Extremo Oriente e nas Américas Central e do Sul, com aproximadamente 500.000 novas infecções registradas cada ano.

No sul da Europa (incluindo Turquia), a leishmaniose causada por L. infantum é endêmica, com um total de 3.950 novos casos humanos relatados a cada ano.

Os cães exercem um papel importante como principais hospedeiros reservatórios da leishmaniose visceral zoonótica. De fato, a leishmaniose canina (CanL) está entre as doenças parasitárias oriundas de vetores mais disseminadas que afetam cães de todos os continentes, exceto a Oceania.

Em áreas em que os vetores competentes (ou seja, mosquitos-palha flebotomíneos (flebótomos) do gênero Phlebotomus (no Velho Mundo) e no Lutzomyia (nas Américas)) são disseminados, infecções humanas e caninas são proximamente associadas [6,7] e os

"hotspots" de infecção correspondem a áreas cujas condições ambientais e climáticas são ideais para o desenvolvimento dos vetores artrópodos.

Portanto, nas últimas décadas, esforços consideráveis têm sido direcionados para o monitoramento da prevalência e incidência de CanL em áreas tanto endêmicas quanto não endêmicas, bem como para o desenvolvimento de novas estratégias de controle custo-efetivas contra essa doença devastadora.

Estudos recentes têm relatado a difusão de CanL por L. infantum em áreas previamente não endêmicas (por exemplo, do norte da Argentina ao norte dos Estados Unidos e algumas províncias do sul do Canadá).

A doença também tem se disseminado das regiões mediterrâneas meridionais para o norte da Europa.

A CanL é altamente prevalente em cães na América do Sul e nas regiões mediterrâneas, com até 60% dos cães infectados sendo assintomáticos, tornando as estimativas atuais de prevalência de infecção baseadas na detecção de sinais clínicos não confiáveis em áreas tanto não endêmicas quanto hiperendêmicas.

Como consequência das complexidades ecoepidemiológicas envolvidas na via de transmissão de L. infantum, o controle de CanL tem se mostrado desafiador, e nenhuma das estratégias propostas (por exemplo, eliminação de cães no Brasil, aplicação ambiental de spray com inseticidas) tem produzido resultados satisfatórios até agora.

Por exemplo, o uso de aplicação doméstica de spray de diclorodifeniltricloroetano (DDT) contra flebótomos no Brasil não tem tido sucesso, provavelmente devido a uma falha em aplicar o inseticida no momento certo do ano e à impraticabilidade de atingir os locais de reprodução naturais desses insetos.

Os organoclorados [por exemplo, DDT e hexacloreto de benzeno (BHC)] também têm sido substituídos gradualmente por piretroides sintéticos devido a efeitos colaterais ambientes e riscos de saúde humana.

O uso de piretroides com propriedades repelentes em formulações spot-on ou como coleiras impregnadas tem representado uma abordagem útil e custo-efetiva para reduzir o risco de infecção por L. infantum em cães em áreas endêmicas.

Em um estudo anterior, o uso de coleiras caninas impregnadas com deltametrina resultou em uma taxa de proteção contra infecções caninas por L. infantum de 50 e 86%, respectivamente, por duas temporadas de transmissão consecutivas na Europa.

Uma combinação de imidacloprida a 10% e permetrina a 50% em uma formulação spot-on também foi efetiva na redução de infecção por L. infantum em grandes populações de cães em canis, bem como na redução de várias doenças caninas oriundas de carrapatos (por exemplo, babesiose e trombocitopenia cíclica canina, causadas por Babesia canis e Anaplasma platys, respectivamente), tanto em animais autóctones quanto em cães beagle virgens de infecção que foram introduzidos experimentalmente em um ambiente de canil junto com cães nativos infestados por carrapatos.

Recentemente, desenvolveu-se uma coleira de matriz polimérica que contém uma combinação de imidacloprida a 10% e flumetrina a 4,5% (Seresto® , Bayer Animal Health), doravante referida como "coleira", com propriedades tanto repelentes quanto inseticidas contra pulgas e carrapatos, para uso em cães e gatos.

Estudos eficazes anteriores demonstraram proteção contra infestações por carrapatos e pulgas por um período de oito meses, que foram atribuídos tanto ao sistema de matriz de liberação lenta da coleira quanto à ação sinérgica entre o piretroide flumetrina e o neonicotinoide imidacloprida.

Apesar desses resultados promissores, não estão disponíveis dados que descrevam a atividade repelente dessa formulação de coleira contra flebótomos ou sua eficácia na prevenção de CanL em áreas endêmicas.

No presente estudo, tratamos desse hiato no conhecimento por meio de uma investigação da eficácia dessa coleira para a prevenção de infecções por L. infantum em cães jovens que vivem em uma área hiperendêmica do sul da Itália.

Materiais e Métodos

Declaração ética

O estudo foi realizado de acordo com os princípios de Boas Práticas Clínicas (VICH GL9 GCP, 2000 http://www.emea.eu.int/pdfs/vet/vich/059598en.pdf), com a diretriz para teste e avaliação da eficácia de substâncias antiparasitárias para tratamento e prevenção de infestação por carrapatos e pulgas em cães e gatos (EMEA/CVMP/005/00, 2000 http://www.emea.eu.int/pdfs/vet/ewp/000500en.pdfl) e com a diretriz sobre Princípios Estatísticos para Estudos Clínicos Veterinários (CVMP/816/00, 2000 www.emea.eu.int/pdfs/vet/ewp/081600en.pdf).

O desenho do estudo e os procedimentos experimentais foram aprovados e autorizados pelo Ministério da Saúde italiano (número de autorização DGSA no 0001997; 04/02/2011).

Área do estudo

O estudo foi realizado de março de 2011 a outubro de 2012, em um abrigo particular de animais em Putignano, província de Bari, região da Apúlia, Itália (latitude 40o51 N, longitude 17o7 E, altitude de 372 m acima do nível do mar).

O abrigo é administrado por uma associação civil particular. A ocorrência de flebótomos no local de estudo foi monitorada nos três anos anteriores; estimou-se uma incidência bruta anual de 47,6% de infecção por L. infantum na população canina nativa nos dois anos anteriores.

Permitiu-se que aproximadamente 200 cães não inscritos no protocolo do estudo errassem livremente nos arredores, com o propósito de manter as condições naturais de infecção existentes no local de estudo.

Desenho do estudo e procedimentos experimentais

Este estudo de campo foi desenhado para avaliar a eficácia de coleiras para a prevenção de infecção por L. infantum em cães.

No dia da inscrição, aplicou-se uma coleira ao redor do pescoço de cada cão do Grupo A e adaptou-se o comprimento desta ao tamanho do cão com um mecanismo de fecho por lingueta.

Pontas sobrepostas foram cortadas para acomodar o comprimento exigido e evitar que outros cães mastigassem a ponta solta.

Cães com < 6 meses de idade foram designados por cara ou coroa para dois grupos diferentes: Grupo A - cães tratados com as coleiras no dia 0 e que permaneceram sob tratamento até março de 2012; Grupo B - cães controle não tratados.

Avaliou-se a homogeneidade dos dois grupos em relação aos dados epidemiológicos dos cães (por exemplo, sexo, peso e comprimento do pelame) usando o teste do qui-quadrado e uma ANOVA unidirecional no dia da inscrição.

As coleiras foram aplicadas nos cães do Grupo A de acordo com seu peso corporal (faixas de dose de coleira: <= 8 kg: coleira pequena; > 8 kg: coleira grande). As coleiras foram trocadas de acordo com o aumento do peso corporal dos cães em crescimento por todo o estudo e quando foi aplicável.

Qualquer perda/remoção de coleira foi registrada e coleiras perdidas/removidas foram reaplicadas imediatamente; qualquer coleira irreparavelmente danificada foi trocada por uma nova dentro de dois dias.

De acordo com as diretrizes EMEA/CVMP/005/00-Rev2, cada cão foi fotografado identificado individualmente usando-se microchips.

Devido à visibilidade das coleiras, o pessoal envolvido no manejo direto dos animais não ficou cegado quanto à designação para grupo de tratamento ou controle; entretanto, o pessoal do laboratório não foi informado sobre a composição dos grupos do estudo, e a designação do grupo não foi indicada nos tubos de amostra e lâminas.

Todos os dados associados com cada cão (ou seja, sexo, idade, peso e comprimento do pelame) foram registrados em fichas individuais em sua inscrição, de março a abril de 2011 (linha-base).

Cada cão foi examinado clinicamente e foram coletadas amostras séricas, sanguíneas, de medula óssea e de swab conjuntival para testes.

Foram coletados swabs conjuntivais e biópsias cutâneas a partir de todos os cães incluídos no estudo no primeiro, no segundo e no terceiro momentos de acompanhamento (julho, setembro e novembro de 2011, respectivamente) e no quarto ponto de checagem de acompanhamento (março de 2012, teste final), enquanto se amostrou a medula óssea na linha-base e no quarto ponto de checagem de acompanhamento (Tabela 1).

Os cães foram examinados clinicamente a cada dez dias por todo o estudo e em cada ponto de checagem de acompanhamento. Os sinais clínicos sugestivos de CanL (por exemplo, lesões oculares, lesões cutâneas, perda de peso e linfadenomegalia) foram relatados no registro médico individual de cada cão.

Em março de 2012, no final do período de tratamento, os cães de ambos os Grupos A e B que não foram adotados por cidadãos particulares permaneceram não tratados até outubro de 2012 e, com isso, facilitou-se a exposição a L. infantum por toda a temporada de flebótomos seguinte.

Em outubro de 2012, realizou-se uma coleta de amostras completa nos 111 animais restantes (62 do Grupo A e 49 do Grupo B, respectivamente).

Esses testes de acompanhamento, incluindo testes sorológicos e citológicos e PCR, foram realizados sete meses após a remoção das coleiras (março de 2012) para determinar a incidência de CanL entre os cães com coleira (Grupo A) ou sem coleira (Grupo B) no ano anterior e que foram deixados sem tratamento por toda a temporada de flebótomos seguinte (maio-outubro de 2012).

Animais experimentais, alojamento e tamanho de amostra

Dos 176 cães jovens inscritos no estudo, 52 (29,5%) morreram dentro das primeiras seis semanas como consequência de um surto de parvovirose canina (dados não exibidos).

Foram incluídos os 124 cães restantes de ambos os sexos, de várias raças, com < 6 meses de idade e abrigados no abrigo de animais. Todos os cães estavam em condições de saúde aceitáveis, que cumpriam os critérios de inclusão veterinários na linha-base, no dia de início 0 (SD 0).

Cada cão foi vacinado por meio de duas injeções intramusculares (em um intervalo de duas semanas) de Duramune® DAPPI+LC (Fort Dodge Animal Health, Itália) contra patógenos caninos comuns (parvovírus canino, adenovírus tipo 2, vírus da cinomose, Leptospira canicola e Leptospira icterohaemorrhagiae) e foi vermifugado usandose uma combinação de febantel/pirantel/praquizantel (Drontal Plus® , Bayer AG, Alemanha), seguindo as instruções dos fabricantes.

Os cães foram mantidos em gaiolas de tela de arame (n = 21) de aproximadamente 10 m x 20 m, localizadas próximo a muros de pedra, conhecidos por representarem os locais de repouso naturais de flebótomos.

As cercas separando as gaiolas dos grupos tratado e não tratado tinha espaçamento de pelo menos 2 m. Todos os cães foram mantidos sob as mesmas condições de alojamento antes, durante e após o estudo e foram alimentados com ração comercial uma vez ao dia, enquanto água era fornecida ad libitum.

Os cães só foram retirados do estudo se sua saúde geral se deteriorasse, se fossem observadas lesões cutâneas relacionadas à aplicação do produto ou se morressem.

Não se permitiu o uso de outros ectoparasiticidas nos animais do estudo ou no ambiente por todo o período do estudo, exceto quando as circunstâncias (por exemplo, infestações fortes por carrapatos ou pulgas) representavam uma ameaça ao bem-estar dos cães.

Procedimentos diagnósticos

As amostras sanguíneas (2 mL) foram coletadas a partir das veias braquiais ou jugulares e transportadas para a Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade de Bari (Itália) em frascos com ácido etilenodiaminotetra-acético (EDTA).

As amostras eram centrifugadas no mesmo dia a 1.678 g por 10 minutos, e os soros eram separados e armazenados em tubos Eppendorf individualmente rotulados a -20oC até serem testados.

As amostras de medula óssea foram obtidas por meio de aspiração a partir da crista ilíaca utilizando-se agulhas Rosenthal (calibres 16 ou 18) e armazenadas a -20oC em tubos Eppendorf individuais com 1 mL de solução salina-tampão de fosfato (PBS) até o procedimento molecular.

Além disso, foram feitos esfregaços de amostras de medula óssea em lâminas para exame citológico em um esforço para detectar amastigotos de L. infantum.

As amostras de tecido cutâneo de aproximadamente 0,5 cm2 foram coletadas a partir da região intraescapular e foram processadas conforme descrito anteriormente. Os swabs conjuntivais foram transferidos para tubos que continham solução salina fisiológica até a chegada ao laboratório e foram armazenados a -20oC.

Realizou-se um teste de anticorpos imunofluorescentes indireto (IFAT) usando-se pró-mastigotos do zimodema MON1 de L. infantum como antígeno, conforme descrito em outro local.

As amostras foram classificadas como sendo positivas quando se conseguiu observar uma fluorescência clara de citoplasma ou membrana com pró- mastigotos, utilizando uma diluição de corte de 1:80; os soros positivos foram titulados até ficarem negativos.

As preparações citológicas dos esfregaços de medula óssea foram examinadas microscopicamente por meio de coloração com MGG Quick Stain (Bio Optica, Itália) para detectar a presença de amastigotos.

Realizou-se uma PCR para amplificação do DNA de Leishmania em amostras de medula óssea, swab conjuntival e pele. O DNA total foi extraído usando-se QIAampDNA Micro Kit (Qiagen, GmbH, Hilden, Alemanha) e o Genomic DNA Purification Kit (Gentra Systems, Minnesota, EUA), respectivamente, e amplificou-se um fragmento de minicírculo de DNA de cinetoplasto de L. infantum utilizando o kit de primer de MC1/MC2.

Os amplicons foram redissolvidos em géis de agarose corados com brometo de etídio (a 2%) (Gellyphor, Itália) e dimensionados por meio de comparação com marcadores na Gene Ruler™ 100 bp DNA Ladder (MBI Fermentas, Lituânia). Os géis foram fotografados usando-se um sistema de documentação digital (Gel Doc 2000, BioRad, Reino Unido).

Procedimentos de exame ambiental

Avaliou-se a densidade da população de flebótomos de maio a outubro de 2011 e 2012, utilizando armadilhas pegajosas recobertas com óleo de rícino (30 cm x 21 cm) por períodos de 24 h.

Os flebótomos foram coletados duas vezes por mês após sua primeira aparição e, depois, a cada 3 semanas, até a coleta do último inseto.

Os flebótomos foram contados e identificados no nível de espécie de acordo com Maroli et al. . Os valores médios de temperatura e umidade relativa foram registrados por todo o período do estudo por um registrador de dados (HD 206 Delta OHM, Pádua, Itália) a cada 30 min, por um total de 48 registros por dia.

Depois, calculou-se a temperatura (oC) e a umidade relativa (%) médias durante o dia inteiro (24 h) e a noite (9:00 da noite a 4:00 da manhã).

Análise estatística

Calculou-se o tamanho de amostra mínimo (n = 49) utilizando o software WinEpi (http://www.winepi.net/uk/index.htm) para estimar diferenças entre as proporções (ou seja, incidência) a partir de duas populações e com as seguintes suposições:

  • (i) proporção esperada no Grupo A (ou seja, animais tratados) = 5%;
  • (ii) incidência esperada no Grupo B (animais não tratados) = 15%;
  • (iii) potência = 85%;
  • (iv) nível de confiança = 95%.

Para superar a perda potencial de animais por todo o estudo, foram inscritos > 60 cães, em vez de 49, em cada grupo (63 no Grupo A e 61 no Grupo B, respectivamente).

Além disso, a incidência de infecções por L. infantum foi determinada por meio da taxa de densidade de incidência (IDR), calculada como segue: IDR = número de cães positivos quanto a L. infantum/número de cães-meses de acompanhamento (ou seja, o número de meses entre a avaliação anterior e a seguinte para cada cão em risco de infecção por L. infantum).

As diferenças entre as taxas de incidência nos Grupos A e B foram calculadas usando-se o teste de Yates corrigido / 2.

Cães testados uma vez (por exemplo, perdidos, mortos) não contribuíram para o cálculo de incidência, enquanto cães amostrados em pelo menos dois pontos de checagem contribuíram para o cálculo de IDR com o número de meses nos quais permaneceram no estudo.

Também se calculou a incidência bruta anual (calculada considerando-se os resultados de testes no final do estudo).

A análise de eficácia da coleira na prevenção de CanL foi baseada na população, o que combinou razoavelmente com o protocolo, e foi avaliada com base na proteção do animal contra infecção por L. infantum durante o período em risco.

A infecção foi diagnosticada em cada acompanhamento e calculada usando-se a seguinte fórmula: % de proteção = (% de animais positivos no grupo controle - % de animais positivos no grupo tratado/% de animais positivos no grupo controle) x 100.

No caso deste estudo, definiu-se "cão positivo" como qualquer cão que esteve positivo quanto a L. infantum por citologia, sorologia (título de anticorpos > 1:80) ou PCR em um ou mais desses testes diagnósticos, consequentemente incluindo todos os cães com evidências que sustentassem uma exposição a flebótomos que tivesse resultado na transmissão de L. infantum, independentemente de a infecção ter progredido para doença.

Resultados

Os animais com coleira (n = 63; Grupo A) e controle (n = 61; Grupo B) foram homogêneos (p > 0,05) em termos de sexo, idade, peso e comprimento de pelame.

Após a inscrição no estudo, 9 (7,2%) cães morreram logo depois do segundo ponto de checagem de acompanhamento (ou seja, um do Grupo A e 8 do Grupo B), enquanto dois cães do Grupo B haviam morrido no terceiro e quarto pontos de checagem de acompanhamento, respectivamente.

Dos 124 cães avaliados inicialmente por meio de testes sorológicos, parasitológicos e moleculares, apenas um (0,06%) foi positivo quanto a L. infantum (com base na amplificação do DNA do parasita por PCR a partir de uma amostra cutânea).

Esse cão (Grupo A) permaneceu no mesmo recinto, junto com três outros cães do mesmo grupo, embora isso não tenha sido considerado no cálculo da incidência.

A Tabela 1 mostra as IDR de cada grupo nos sucessivos pontos de checagem de acompanhamento.

Nenhum cão no Grupo A ficou positivo quanto a L. infantum, enquanto se diagnosticou infecção por Leishmania (aferida por meio de positividade em pelo menos um dos três testes realizados (ou seja, sorologia, citologia e PCR) no primeiro, no segundo, no terceiro e no último pontos de checagem de acompanhamento) em 21 (IDR = 45,1%) cães no Grupo B.

Dos 51 cães no Grupo B que estavam disponíveis no ponto de checagem de acompanhamento final, 18 estavam positivos quanto a L. infantum, consequentemente resultando em uma incidência bruta anual de 35,3%.

A Tabela 2 descreve os resultados de sorologia, citologia e PCR em diferentes tecidos para cada cão positivo. Nenhum cão estava positivo no primeiro acompanhamento (ou seja, junho) e apenas um cão estava positivo no segundo acompanhamento (setembro de 2011); no terceiro acompanhamento (novembro de 2011), dez cães haviam se tornado sorologicamente positivos.

Desses, sete também foram positivos na PCR cutânea. Vinte de 21 cães (ver Tabela 2) permaneciam positivos em uma ou mais modalidades de teste no quarto ponto de checagem de acompanhamento (final).

Todos esses cães eram soropositivos, com nove deles sendo positivos na PCR de medula óssea e, desses, seis também sendo positivos na PCR cutânea; amastigotos foram detectados no exame citológico da medula óssea de três cães.

Todos os cães foram positivos na PCR realizada no swab conjuntival, mas um deles também foi positivo na PCR de medula óssea, assim indicando um status disseminado da infecção.

Os títulos de anticorpos foram altos (variando de 1:160 até 1:1.240) em todos os cães que foram positivos na PCR de medula óssea no ponto de checagem de acompanhamento final.

Além disso, o cão 17 apresentou um título de anticorpos de 1:1.240 e exibiu positividade na citologia e na PCR tanto da pele quanto da conjuntiva (Tabela 2).

Cinco (27,8%) dos 18 cães que foram positivos na sorologia e em dois testes diagnósticos adicionais (Tabela 2) exibiam sinais clínicos (ou seja, linfadenomegalia, dermatite furfurácea, onicogrifose, depressão e perda de peso, diarreia) em abril de 2012 (Figura 1), com as anormalidades hematológicas consistindo principalmente de anemia, leucocitose, neutrofilia com desvio à esquerda, linfocitose, monocitose, eosinofilia, trombocitopenia, hipoalbuminemia e hipergamaglobulinemia.

Nenhum cão do Grupo A testou positivamente quanto a Leishmania durante o estudo, levando a uma eficácia de proteção final de 100% nos animais com coleira.

As coleiras foram trocadas nos cães jovens em diferentes momentos (ou seja, 8 dentro de 3 meses; 35 dentro de 6 meses; e 20 dentro de 8 meses).

Embora a troca tenha sido devida predominantemente ao aumento do peso corporal (n = 46; 73%), uma segunda troca de coleira se tornou necessária em alguns casos (n = 17; 27%) devido a perda de coleiras durante brigas ou brincadeiras.

Quatro cães precisaram de uma terceira troca de coleira dentro de 1,3 meses a partir da segunda troca de coleira, e dois deles destruíram repetidamente a coleira, consequentemente necessitando de uma quarta (dentro de 1,3 meses) e uma quinta (dentro de 1,1 meses) trocas.

Desses, um cão precisou de duas trocas de coleira adicionais (com intervalos de 2,3 e 2,1 meses, respectivamente).

Devido à alta pressão de carrapatos no ambiente e nos animais no Grupo B, autorizou-se um tratamento ambiental fora dos recintos que alojavam os cães do Grupo B por duas vezes, com Bayticol (flumetrina) e um tratamento "nos animais" com Frontline Combo (fipronil e metopreno), em junho de 2011 e em agosto de 2012, respectivamente.

Após o final do período de tratamento (março de 2012), 111 animais (62 do Grupo A e 49 do Grupo B) permaneceram não tratados por toda a temporada de flebótomos seguinte.

Em outubro de 2012, desses 111 cães, 8/62 do Grupo A (12,9%) e 29/49 do Grupo B (59,2%) testaram positivamente quanto a L. infantum, levando a uma incidência anual global de 20,6% em 2012 (19 casos novos dentre 92 cães negativos em março de 2012) quanto a L. infantum, sete meses após as coleiras terem sido removidas.

Em ambos os anos, os flebótomos apareceram primeiro durante a última semana de maio, quando a temperatura subiu e a umidade relativa caiu, com a maior parte dos espécimes de flebótomos sendo coletada em julho.

A última coleta de flebótomos ocorreu em meados de outubro de 2011 e no final de setembro de 2012.

Em ambos os anos, Sergentomyia minuta (66,6%) foi a espécie mais frequentemente identificada, seguida por Phlebotomus perniciosus (15,1%), Phlebotomus neglectus (8,8%) e Phlebotomus papatasi (0,23%).

Os espécimes remanescentes foram identificados como sendo Phlebotomus spp. (9,3%) devido às suas condições deterioradas.

A maioria dos espécimes de P. perniciosus foi coletada em agosto e julho de 2011 e 2012, respectivamente, quando se registraram as temperaturas médias mensais mais altas e baixas umidades relativas mensais médias.

Discussão

O presente estudo descreve os resultados da primeira investigação de grande escala da eficácia de uma combinação de imidacloprida a 10% e flumetrina a 4,5% em uma formulação de coleira para prevenção de uma das doenças zoonóticas oriundas de artrópodos mais importantes dos cães em todo o mundo.

Essa combinação provou ser segura e 100% eficaz em evitar a infecção por L. infantum em cães jovens após sua primeira exposição ao agente etiológico da CanL em uma área hiperendêmica.

Os cães foram tratados de acordo com o aumento de seu peso corporal e as coleiras foram trocadas, se necessário, devido ao crescimento do animal, a uma perda de coleira ou ao final do período de eficácia de rótulo de 8 meses.

O tempo de uso de uma única coleira variou de um mínimo de 3 meses (n = 8 indivíduos) até 6 (n = 35) e mesmo 8 (n = 20) meses.

De acordo com isso, investigou-se a eficácia protetora da coleira contra L. infantum por todo um período de 6-8 meses em 87,3% (n = 55) dos animais com coleira. Com base no conhecimento atual da dinâmica sazonal dos flebótomos, bem como nos dados aqui exibidos, a duração da proteção conferida por uma única coleira se estende por toda uma temporada de flebótomos no sul da Itália.

A eficácia prolongada da combinação de imidacloprida a 10% e flumetrina a 4,5% é ligada mais provavelmente ao fato de a matriz da coleira permitir uma liberação uniforme dos ingredientes ativos em uma concentração constante, diferentemente das coleiras com deltametrina registradas.

Ao mesmo tempo em que nenhum cão com coleira (Grupo A) foi infectado por L. infantum, foram registradas IDR tão altas quanto 45,1% nos cães deixados sem coleira (Grupo B).

Essa alta incidência difere das observações anteriores realizadas na mesma área, correspondendo aproximadamente a uma incidência 3 vezes mais alta do que a previamente registrada em cães com proprietário (9,5%) e de canil (13,6%), respectivamente.

No entanto, a incidência de infecção por L. infantum detectada por técnicas parasitológicas, sorológicas e moleculares foi semelhante à registrada em dois estudos anteriores realizados no mesmo canil (IDR = 44,4%), o que confirma a atividade persistente de flebótomos nesse local.

A alta endemicidade entre a população canina dessa área também pode ser aferida pela ocorrência de sinais indicativos de leishmaniose (ou seja, dermatite furfurácea, onicogrifose, letargia, má condição corporal, anorexia e linfadenomegalia) em cinco dos 18 (27,7%) cães no Grupo B após exposição a flebótomos durante apenas uma temporada de vetores (março de 2012).

Esses cães também exibiram anormalidades laboratoriais compatíveis com CanL (ou seja, anemia, eosinofilia, trombocitopenia, hipoalbuminenia e hipergamaglobulinemia e, em dois casos, azotemia).

Nenhum cão com coleira se soroconverteu, se tornou positivo em PCR ou exibiu sinais clínicos indicativos de CanL, que pudessem ser atribuídos à atividade antialimentação dos insetos da flumetrina.

De fato, sabe-se que esse composto reduz o número de picadas de insetos e, por sua vez, o desafio da infecção e, com isso, impede um desvio para uma resposta imune não protetora e para o desenvolvimento da doença.

A taxa de proteção global contra CanL foi mais alta do que a calculada em estudos realizados utilizando coleiras com deltametrina (máximo de 86%) no sul da Itália, onde têm sido registradas incidências de infecção pós-exposição de até 91,7%.

Também se avaliou a segurança da coleira avaliada neste estudo; o mecanismo de lingueta integral de fecho de segurança da coleira mostrou ser fundamental na garantia da segurança do produto, especialmente em cães jovens de canil abrigados em grupo e vivendo no mesmo recinto, ao permitir que a coleira fosse alargada em distância até a primeira costela, assim evitando acidentes durante brincadeiras ou brigas.

Pôde-se associar o número de perdas de coleira registrado (27%) à alta atividade e à atitude brincalhona dos animais jovens, bem como ao primeiro cio das fêmeas e a brigas relacionadas a cruza entre machos no mesmo ambiente confinado.

Dois cães destruíram repetidamente a coleira, exigindo até sete reposições. Globalmente, mesmo na presença de uma alta densidade animal em um ambiente confinado, a taxa de perda de coleiras foi mais baixa do que a registrada em estudos anteriores realizados com cães com proprietário (até 35%).

Os aspectos ecológicos das populações de flebótomos durante os dois anos foram semelhantes aos observados em estudos anteriores realizados no mesmo local, com P. perniciosus e P. neglectus sendo as espécies mais representadas.

O número relativamente baixo de flebótomos coletados durante o primeiro e o segundo ano do estudo pode se relacionar com tratamentos ambientais com Bayticol (flumetrina), que foram realizados em junho de 2011 e agosto de 2012 para reduzir infestações fortes por carrapatos.

Entretanto, a ocorrência constante de flebótomos é indicativa do risco real de infecção por L. infantum em cães e humanos nessa área. O abrigo de cães escolhido para esta pesquisa se localiza a cerca de 200 m das residências mais próximas em Putignano.

Uma área verde com vegetação mediterrânea, oliveiras e cerejeiras circunda o canil, que é delimitado por muros de pedra, que representam locais de repouso típicos para flebótomos.

A ocorrência de cinco espécies de flebótomos (ou seja, P. perniciosus, P. neglectus, P. papatasi e S. minuta) coletados neste estudo confirma os resultados das pesquisas entomológicas anteriores realizadas no sul da Itália e indica um alto grau de riqueza de espécies nas populações desses vetores artrópodos nessa área urbana.

Sob as circunstâncias acima, a inscrição de cães abrigados em canis em uma área hiperendêmica (em vez de cães de propriedade privada) tem relevância, considerando que o grande número de animais positivos quanto a L. infantum atua como uma fonte natural de infecção para flebótomos nessa localização específica e reduz a tendência de uma falta de controle sobre as decisões tomadas por proprietários individuais, as diferentes práticas de manejo (por exemplo, cães mantidos dentro de casa durante a noite) e o risco do tratamento dos animais e/ou do ambiente com ectoparasiticidas.

Os cães confinados também ficaram sujeitos à mesma pressão de picadas de flebótomos, o que é garantido pelos mesmos micro-hábitats dos flebótomos e por uma carga semelhante de flebótomos.

Como consequência dos múltiplos fatores que determinam se e quão rapidamente ocorre uma progressão para leishmaniose após uma infecção por L. infantum em cães individuais (por exemplo, resposta imune, nível de exposição e transmissão repetida por picadas de flebótomos infectados), estabeleceu-se o status de "positivo" de cada cão desse estudo utilizando uma combinação de resultados de testes sorológicos (IFAT), parasitológicos (citologia) e moleculares (PCR) realizados em diferentes fontes de amostra (ou seja, medula óssea, creme leucocitário, swab conjuntival e pele).

Com exceção de um cão (cão 20), os cães positivos sem coleira foram detectados pela primeira vez em novembro de 2011 por meio de testes sorológicos (n = 10) e PCR em amostras cutâneas, consequentemente indicando que todos os cães foram expostos a L. infantum durante a primeira temporada de flebótomos.

A progressão da infecção à doença clínica foi confirmada pelo fato de que todos esses cães, exceto um, permaneceram soropositivos e positivos em PCR de medula óssea nos pontos de checagem de acompanhamento subsequentes, e nove de 21 cães também foram citologicamente positivos com base na detecção de amastigotos.

A sorologia falhou em detectar infecção em seis de 21 cães positivos que eram positivos em citologia ou PCR, consequentemente indicando que essa sorologia deve ser usada em combinação com outros testes diagnósticos para avaliar o status de infecção de cães expostos a flebótomos em regiões endêmicas.

Esse achado é mais provavelmente relacionado ao fato de que os cães infectados por L. infantum (especialmente se forem assintomáticos) podem não se soroconverter imediatamente, pois o período de incubação antes da soroconversão pode variar de 3 meses a 7 anos.

Logo, quando considerada sozinha, a soronegatividade pode levar a resultados falsos negativos nos grupos controle e de estudo.

Neste estudo, a detecção dos parasitas (citologia) e/ou a soropositividade só foram associadas com sinais clínicos em 27,7% dos cães infectados por L. infantum, consequentemente confirmando os resultados de estudos anteriores, que indicaram que uma grande proporção de cães infectados permanece assintomática por períodos prolongados.

Com base nesse conhecimento, estudos anteriores que empregaram apenas técnicas sorológicas para aferir a eficácia de inseticidas para prevenção de infecções por L. infantum devem ser considerados com cuidado.

Comentários conclusivos

Embora a atividade dos flebótomos no sul da Europa tenha picos durante o verão (ou seja, junho, julho e agosto), o risco de picadas de flebótomos se estende do final da primavera até o outono, coincidindo com o pico de turismo nessas áreas e, portanto, maximizando o risco de aquisição de leishmaniose canina e humana, com a subsequente introdução de cães infectados em áreas não endêmicas.

Portanto, a proteção de populações caninas que podem atuar como reservatório importante de infecção por L. infantum é crucial (pelo menos) entre maio e outubro.

Os resultados do presente estudo indicam que o uso de imidacloprida a 10% e flumetrina a 4,5% em formulações de coleira proporciona proteção de longo prazo (ou seja, até 8 meses), confiável e sustentável contra infecção por L. infantum em áreas hiperendêmicas.

O uso disseminado dessa medida profilática efetiva, combinada com estratégias de controle adicionais direcionadas para reduzir a infecção por L. infantum nas populações de flebótomos nas mesmas áreas auxiliará finalmente na eliminação dos riscos para as populações canina e humana da mesma forma.

Conforme discutido anteriormente, precisa-se criticamente da abordagem de "Saúde Única" para o controle da leishmaniose.

Agradecimentos

Agradecemos a Sabrina Gallo e Angelo Carucci (clínicos no Centro Veterinario "S. Francesco", Putignano, Bari) e a Anna Sara De Tommasi, Alessio Giannelli e Rafael A. Ramos (Universidade de Bari, Itália) pelo trabalho de campo.

Contribuições dos autores

Conceberam e desenharam os experimentos: DO e DS. Realizaram os experimentos: DO, FDT, DDC, GDP, VT, MSL, RPL, GA, GC e DS. Analisaram os dados: DO, FDT, DDC, GDP, VT, MSL, RPL, GA, GC e DS.

Contribuíram com reagentes/materiais/ferramentas de análise: DO, GC e DS. Redigiram o artigo: DO, FDT, DDC, EB, CC, GC e DS.