Vacina contra o parvovírus canino tipo 2 protege contra o desafio virulento com o vírus tipo 2c

Empresa

MSD

Data de Publicação

31/12/2000

PDF

1. Introdução

O parvovírus canino (CPV2) é um vírus DNA de cadeia simples, que é responsável por uma enterite aguda e às vezes fatal em cães (Kelly, 1978; Appel et al., 1979). O vírus, que apareceu pela primeira vez em 1977/1978, provavelmente surgiu de um vírus estreitamente relacionado a gatos, o vírus da panleucopenia felina (FPLV) através de um pequeno número de mutações na única proteína decapsídeo; um salto da espécie que pode ter envolvido passagem intermediária em outros carnívoros como marta ou guaxinim (Truyen et al., 1996). Já em 1979, apareceram as primeiras variantes do CPV2, denominadas CPV2a, e foram rapidamente seguidas do surgimento do CPV2b em 1984. (Parrish et al., 1985, 1991).O vírus tipo 2 original atualmente desapareceu do campo e foi substituído pelas variantes 2a e 2b; se bem que as proporções relativas destes dois tipos variam de país para país (Truyen et al., 1996; Chinchkar et al., 2006; Pereira et al., 2007).

As mudanças do aminoácido na proteína do capsídeo (VP2), que caracteriza a mudança de 2 para 2a e para 2b, são muito limitadas. As substituições nas posições 87 (Met para Leu), 300 (Gly para Ala), 305 (Tyr para Asp) e 555 (Val para Ile) ocorreram na evolução de 2 para 2a e 426 (Asn para Asp) e 555 (Ile para Val) no surgimento da 2b a partir de 2a (Parrish et al., 1991; Truyen et al., 1995). No entanto, como as cepas 2a recentes desprovidasda substituição de Val para Ile na posição 555 foram reportadas (Wang et al., 2005; Martella et al., 2006), então, uma mudança de um único aminoácido pode diferenciar as sequências VP2 em CPV2a e CPV2b. Mais recentemente, têm surgido cepas na Itália nas quais o aminoácido na posição 426 (Asn na 2a e Asp na 2b) se tornou um resíduo de ácido glutâmico (Buonavoglia et al., 2001; Martella et al., 2004). O fato de que estas variantes Glu 426, denominadas vírus CPV2c, estão circulando e coexistindo com outros tipos de CPV na Itália e outros países europeus (Decaro et al., 2006b; C. Buonavoglia, comunicação pessoal) e também terem sido isolados em países geografcamente diversos como Vietnã e Escócia (Nakamura et al., 2004; C. Buonavoglia, comunicação pessoal) sugere que eles têm uma vantagem em, pelo menos, uma parte da população de cães.

A evolução relativamente rápida do parvovírus canino resultou na perda e então recuperando o espectro de hospedeiros felinos (Truyen et al., 1996), e esta capacidade recuperada para se replicar em gatos pode bem ser responsável pela substituição do vírus tipo 2 original pelas variantes 2a, 2b e 2c. No fnal dos anos 1970 e início dos anos 1980, ambas as vacinas contra FPL[panleucopenia felina] viva e inativada foram utilizadas para proteger os cães contra doença da CPV devido aos antígenos comuns que estimulavam a proteção cruzada, no entanto os níveis de proteção que elas ofereciam eram fracos e a duração da imunidade era curta. Estas vacinas foram substituídas por vacinas vivasatenuadas contra CPV, que proporcionaram excelente proteção e maior duração da imunidade. Atualmente, as vacinas vivas atenuadas são resultantes de isolados do CPV2b ou do vírus tipo 2 original. Como o vírus tipo 2 foi totalmente substituído no campo pelos vírus 2a, 2b e agora 2c há alguma preocupação quanto ao nível de proteção conferido pelas vacinas tipo 2 atenuadas (Pratelli et al., 2001; Truyen, 1999). Entretanto, com base nos estudos com anticorpos monoclonais disponíveis, cada nova variante antigênica perdeu, pelo menos, um epítopo neutralizante, comparado com a variante anterior (Strassheim et al., 1994; Pereira et al., 2007). Anteriormente, foi demonstrado que a vacina viva atenuada tipo 2 é capaz de proteger cães contra desafos de campo 2a e 2b (Greenwood et al., 1995), embora estudos de neutralização cruzada, realizados in vitro usando soros produzidos contra os vários tipos antigênicos mostram diferenças marcantes (Pratelli et al., 2001). O objetivo deste estudo foi investigar a capacidade de uma vacina viva atenuada tipo 2 (Nobivac-Intervet) proteger cães do desafo com a variante CPV mais recente, o CPV2c

2. Materiais e métodos

2.1. Vírus e cultura de célula2.1. Vírus e cultura de célula

A vacina Nobivac DHPPi (Intervet) contendoparvovírus canino (cepa154 do CPV2), adenovírus canino (tipo 2), vírus da cinomose e vírus parainfluenza, Nobivac Lepto (vacina inativada contra leptospirose – Intervet), e Nobivac Pi (somente vírus parainfluenza vivo) foram utilizadas. Foi utilizada uma cepa patogênica de CPV2c (gentilmente cedida pelo Prof. C. Buonavoglia, Department of Animal Health and Well-being (Departamento de Saúde e Bemestar Animal), Faculty of Veterinary Medicine of Bari (Faculdade de Medicina Veterinária de Bari), Itália) como vírus desafo. CPV2c e CPV2-154 foram multiplicados e titulados em células renais de felino Crandell Rees (CrFK); também foi realizado isolamento de vírus do esfregaço retal nas células CrFK que foram cultivadas essencialmente como descrito por Mochizuki et al. (1993) usando meio M6B8 (Intervet), suplementado com soro fetal bovino a 5% contendo penicilina e estreptomicina

2.2. Sorologia e imunofluorescência

As amostras de soro foram analisadas quanto a anticorpos à parvovirose canina usando ambos os ensaios de inibição de hemaglutinação (Churchill, 1982) e soroneutralização. Foram utilizados os vírus CPV2 e CPV2c no teste HAI a uma constante de 4 unidades HA. Nos ensaios de soroneutralização foram utilizados vírus a um título de 101.76/poço. Foi realizada imunofluorescência como descrito anteriormente (Vihinen-Ranta et al., 1998). Resumidamente, as monocamadas de células CrFK foram fxadas ~72 h pós-infecção com metanol. Foi utilizado anticorpo monoclonal A2F8 anti-CPV (Parrish et al., 1982), seguido de conjugado coelhoanti-camundongo com FITC (SIGMA).

2.3. Estudo de efcácia

Doze cães da raça beagle foram obtidos de cadelas não vacinadas não expostas e, portanto, desprovidos de anticorpos maternos contra parvovirose canina. Todos os cães foram declarados saudáveis e em boa forma física por inspeção veterinária e demonstraram ser soros negativos em relação ao CPV no início do experimento. Os animais foram divididos em dois grupos, vacinados e controles, com seis animais em cada grupo e cada grupo foi alojado separadamente.O grupo vacinado recebeu o intervalo mínimo recomendado de vacinação que consistiu de vacinação às 8-10 semanas de idade com Nobivac Pi e Nobivac Lepto, seguida por uma segunda vacinação 3 semanas mais tarde com Nobivac DHPPi e Lepto.O grupo vacinado, portanto, recebeu apenas uma única vacinação com a vacina contra parvovirose. Os animais controle não foram vacinados. Quatro semanas após a vacinação ambos os grupos foram desafados com o parvovírus CPV2c.Os animais foram privados de alimento por 24 h antes, e por 12 h após o desafo; mas com disponibilidade de água durante todo o período. O vírus desafo (105,0 TCID 50) foi administrado oralmente em um volume de 1,0 ml. Os cães foram sangrados antes da vacinação, antes do desafo e em dias selecionados pós-desafo para a medição das respostas sorológicas e estimativa dos leucócitos/linfócitos. Os animais também foram esfregados em intervalos regulares para isolamento do vírus e observados de perto quanto a sinais clínicos da doença, incluindo mal-estar, redução do apetite, estado geral insatisfatório e sangue nas fezes a partir de 2 dias antes até 14 dias após o desafo

2.4. Análise estatística

Oteste análise de variância de uma via foi realizado usando-se o pacote de sofware estatístico Mini TabTM.

3. Resultados

3.1. Observação clínica

As observações clínicas são apresentadas na Tabela 1.Os animais controle começaram a mostrar sinais clínicos a partir de 4 dias pós-desafo, e no dia 6 pós-desafo três dos cães controle apresentaram sinais clínicos graves e foram sacrifcados por razões de bem-estar.Os animais controle restantes apresentaram sinais menos graves, embora tenham sido necessários eletrólitos orais para ajudar na recuperação.No entanto, o apetite reduzido resultou em uma restrição acentuada noíndice de crescimento (resultados não apresentados).Todos os animais do grupo controle apresentaram diarreiamucoidegrave que também era hemorrágica nos três cães que tiveram que ser sacrifcados, enquanto que o grupo vacinado não apresentou qualquer sinal clínico da doença em qualquer fase durante o experimento. Esfregaços retais colhidos pós-desafo foram examinados quanto ao teor de vírus por cultura em células CrFK (Tabela 2). O vírus pode ser detectado em esfregaços colhidos de todos os animais controle a partir do dia 3 ao dia 7 pós-desafo, ao passo que nenhuma evidência de excreção viral pode ser detectada em quaisquer dos cães vacinados. As médias das contagens de glóbulos brancos (mwcc) são apresentadas na Tabela 3. Os valores foram similares tanto nos cães vacinados como nos controles, antes do desafo, e no grupo vacinado a mwcc não apresentou alteração signifcativa após o desafo (p = 0,12). No grupo controle, no entanto, houve uma diminuição signifcativa (p = 0,003) na mwcc pós-desafo para quase metade do valor pré-desafo.

3.2. Respostas sorológicas

Ao manter sua situação de SPF (livre de patógeno específco) e sua derivação de mães não vacinadas nenhum dos animais teve qualquer anticorpo detectável de parvovírus canino antes da vacinação (dados não apresentados).No momento do desafo, após a vacinação única contra parvovirose, todos os cães vacinados haviam desenvolvido títulos de anticorpos HAI variando de 1600 a 6400 (Tabela 4).Não houve diferença observável no título HAI quando o ensaio foi realizado com antígenos 2c ou da vacina contra parvovírus.As respostas sorológicas também foram medidas em ensaios de neutralização de vírus contra o desafo e vírus da vacina (Tabela 4), e nestes ensaios os vacinados apresentaram uma resposta signifcativamente superior para a cepa tipo 2 em comparação à cepa 2c. Após o desafo, os animais vacinados não apresentam resposta anamnéstica ao CPV, nos ensaios de HAI ou VN, quando o antígeno CPV2c ou o antígeno da vacina foi utilizado. Os animais controle permaneceram soronegativos até o momento do desafo, no entanto, após o desafo os animais controlemontaramuma resposta de anticorpo, que foi notavelmente mais elevada nos animais recuperados em comparação aos animais que foram subsequentemente sacrifcados.

4. Discussão

O parvovírus canino continua a ser um importante patógeno de cães e é responsável por ocorrências graves de morbidade e mortalidade, apesar da disponibilidade de vacinas seguras e efcazes (Decaro et al., 2006a, b). Desde a substituição do vírus tipo 2 original pelas variantes 2a, 2b e mais recentemente os vírus tipo 2c (Parrish et al, 1991; Martella et al, 2004) tem havido preocupações sobre a efcácia das vacinas contra parvovirose canina que se baseiam na cepa tipo 2 original (Martella et al, 2005; Truyen, 2006). Embora tenha sido demonstrado anteriormente que uma vacina tipo 2 é capaz de proporcionar proteção contra isolados de campo 2a e 2b (Greenwood et al., 1995), o surgimento da variante 2c naturalmente levanta a questão se as vacinas tipo 2 podem fornecer,também, proteção contra esta nova variante.Nós, claramente, demonstramos aqui que os cães vacinados com uma dose única de uma determinada vacina contra parvovírus tipo 2 (Nobivac-Intervet) estão protegidos do desafo com um dos isolados de campo tipo 2c, além disso, este isolado foi capaz de causar enterite grave em cães não vacinados.A análise dos esfregaços retais (Tabela 2) revela que os cães vacinados não foram apenas protegidos da doença clínica, mas também que a vacinação impediu a excreção e transmissão do vírus desafo. Este achado está em linha com a capacidade desta vacina tipo 2 evitar excreção e transmissão do vírus tipo 2a e 2b após o desafo (Greenwood et al., 1995).Além disso, a duração da excreção e transmissão do vírus nos animais controle foi similar à observada com outras cepas CPV (Greenwood et al., observações não publicadas).Leucopenia é, muitas vezes, uma consequência da infecção por CPV (Chalmers et al., 1999) e é, por conseguinte, um outro critério, através do qual a infecção e a proteção podem ser determinadas.As contagens de glóbulos brancos (Tabela 3) demonstram que o vírus tipo 2c causa leucopenia nos animais controle não vacinados, enquanto que o grupo vacinado permaneceu normal.Curiosamente uma contagem de glóbulos brancos diferencial não mostrou uma queda específca nos linfócitos normalmente associados à infecção por CPV

Não houve resposta anamnéstica após o desafo nos cães vacinados, indicando que eles tinham imunidade esterilizante ao CPV. Além disso, as respostas HAI no grupo vacinado não mostraram uma diferença acentuada na titulação, seja com o teste realizado com o antígeno 2c ou com o antígeno da vacina tipo 2. No entanto, as respostas dos 3 cães controle, que sobreviveram ao desafo, mostraram uma diferença no HAI, quando medido contra o antígeno 2c comparado ao antígeno da vacina.Todos os animais controle foram capazes de montar uma resposta imune e pode ser que as diferenças nas respostas sorológicas observadas no grupo controle possam ter sido devido, em parte, aos intervalos de amostragem diferentes, em que os cães recuperados foram amostrados 7 dias pós-desafo, enquanto os outros cães controle foram amostrados no momento da eutanásia, no dia 6 pós-desafo.

Estes dados indicam que, embora possa haver diferenças antigênicas entre o vírus tipo 2c e o vírus precursor tipo 2 utilizado na vacina, estas diferenças não têm signifcância material em termos de proteção contra a doença, i.e., existe reatividade cruzada efcaz da vacina tipo 2 contra o vírus 2c. Embora o ensaio de inibição da hemaglutinação tenha sido utilizado rotineiramente para avaliar as respostas sorológicas de proteção nos estudos do CPV, pode-se argumentar que a soroneutralização daria uma visão mais precisa da proteção conferida por uma vacina contra quaisquer cepas de campo variantes. Não surpreendentemente, em todos os cães vacinados, os títulos de neutralização são mais elevados quando medidos contra a cepa da vacina em comparação com o vírus desafo 2c. No entanto, após desafo, os títulos de neutralização contra 2c ou da vacina não aumentaram, indicando que, como apresentado com as respostas HAI, os animais tiveram imunidade esterilizante. Portanto, é interessante observar que os tí- tulos de anticorpos nestes cães foram tão elevados quanto nos cães controle recuperados. Estes e outros dados apoiam a visão de que, apesar das pequenas diferenças entre o vírus tipo 2 original e as agora variantes 2a, 2b e 2c, os cães vacinados com esta vacina tipo 2 montarão uma resposta imunológica forte ao CPV e estão totalmente protegidos contra o desafo de qualquer um dos tipos de CPV atual.

Referências


• Appel, M.J.G., Scott, W.F., Carmichael, L.E., 1979. Isolation andimmunization studies of canine parvo-like virus from dogs withhaemorrhagic enteritis. Vet. Rec. 105, 156–159.
• Buonavoglia, C., Martella, V., Pratelli, A., Tempesta, M., Cavalli,A., Buonavoglia, D., Bozzo, G., Elia, G., Decaro, N., Carmichael,L.E., 2001. Evidence for evolution of canine parvovirustype-2 in Italy. J. Gen. Virol. 82, 3021–3025.
• Chalmers, W.S.K., Truyen, U., Greenwood, N.M., Baxendale, W.,1999. Efcacy of feline panleukopenia vaccine t prevent infectionwith an isolate of CPV2b obtained from a cat. Vet. Microbiol.69, 41–45.
• Chinchkar, S.R., Mohana Subramanian, B., HanumanthaRao, N.,Rangarajan, P.N., Tiagarajan, D., Srinivasan, V.A., 2006. Analysisof VP2 gene sequences of canine parvovirus isolates inIndia. Arch. Virol. 151, 1881–1887.
• Churchill, A.E., 1982. A potency test for inactivated small animalparvovirus vaccines using chicks. J. Biol. Stand. 10, 1–8.
• Decaro, N., Desario, C., Elia, G., Campolo, M., Lorusso, E., Mari,V., Martella, V., Buonavoglia, C., 2006a. Occurrence of severegastroenteritis in pups afer canine parvovirus vaccine administration:a clinical and laboratory diagnostic dilemma. Vaccine25, 1161–1166.
• Decaro, N., Martella, V., Desario, C., Bellaciccio, A.L., Camero, M.,Manna, L., d’Aloja, D., Buonavoglia, C., 2006b. First detectionof canine parvovirus type 2c in pups with haemorrhagic enteritisin Spain. J. Vet. Med. B. Infect. Dis. Vet. Public Health 53, 468–472.
• Greenwood, N.M., Chalmers, W.S.K., Baxendale, W., Tompson,H., 1995. Comparison of isolates of canine parvovirus byrestriction enzyme analysis and vaccine efcacy against feldstrains. Vet. Record. 136, 63–67.
• Kelly, W.R., 1978. An enteric disease of dogs resembling felinepanleukopenia. Aust. Vet. J. 54, 593.
• Martella, V., Cavalli, A., Pratelli, A., Bozzo, G., Camaro, M.,Buonavoglia, D., Narcisi, D., Tempesta, M., Buonavoglia, C.,2004. A canine parvovirus mutant is spreading in Italy. J. Clin.Microbiol. 42, 1333–1336.
• Martella, V., Cavalli, A., Decaro, N., Elia, G., Desario, C., Campolo,M., Bozzo, G., Tarsitano, E., Buonavoglia, C., 2005. Immunogenicityof an intranasally administered modifed live canineparvovirus type 2b vaccine in pups with maternally derivedantibodies. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 12, 1243–1245.
• Martella, V., Decaro, N., Buonavoglia, C., 2006. Genetic andantigenic variation of CPV-2 and implicance in antigenic/geneticcharacterization. Virus Genes 33, 11–13.
• Mochizuki, M., Harasawa, R., Nakatani, H., 1993. Antigenic andgenomic variabilities among recently prevalent parvoviruses ofcanine and feline origin in Japan. Vet. Microbiol. 38, 1–10.
• Nakamura, M., Tohya, Y., Miyazawa, T., Mochizuki, M., Phung,H.T.T., Nguyen, N.H., Huynh, L.M., Nguyen, L.T., Nguyen,P.N., Nguyen, P.V., Nguyen, N.P., Akashi, H., 2004. A novelantigenic variant of canine parvovirus from a Vietnamese dog.Arch. Virol. 149, 2261–2269.
• Parrish, C.R., Carmichael, L.E., Antczack, D.F., 1982. Antigenicrelationships between canine parvovirus type 2, feline panleukopeniavirus and mink enteritis virus using conventionalantisera and monoclonal antibodies. Arch. Virol. 72, 267–278.
• Parrish, C.R., O’Connell, P.H., Evermann, J.F., Carmichael, L.E.,1985. Natural variation of canine parvovirus. Science 230,1046–1048.
• Parrish, C.R., Aquadro, C.F., Strassheim, M.L., Evermann, J.F.,Sgro, J.Y., Mohammed, H.O., 1991. Rapid antigenic-type replacementand DNA sequence evolution of canine parvovirus. J.Virol. 65, 6544–6552.
• Pereira, C.A.D., Leal, E.S., Durigon, E.L., 2007. Selective regimenshif and demographic growth increase associated with theemergence of high ftness variants of canine parvovirus. Infect.Genet. Evol. 3, 399–409.
• Pratelli, A., Cavalli, A., Martella, V., Tempesta, M., Decaro, N.,Carmichael, L.E., Buonavoglia, C., 2001. Canine parvovirusvaccination: comparison of neutralising antibody responses inpupsafer inoculation with CPV2 or CPV2b modifed live virusvaccines. Clin. Diag. Lab. Immunol. 8, 612–615.
• Strassheim, M.L., Gruenberg, A., Veijalainen, P., Sgro, J.-Y., Parrish,C.R., 1994. Two dominant neutralising antigen determinantsof canine parvovirus are found on the threshold of the threefold spike of the virus capsid. Virology 198, 175–184.
• Truyen, U., 1999. Emergence and recent evolution of canine parvovirus.Vet. Microbiol. 69, 47–50.
• Truyen, U., 2006. Evolution of canine parvovirus—a need for newvaccines. Vet. Microbiol. 117, 9–13.
• Truyen,U.,Gruenberg,A.,Chang, S.F.,Obermaier, B.,Veijalainen, P.,Parrish, C.R., 1995. Evolution of the feline subgroup parvovirusesand thecontrolof canine host range invivo. J.Virol.69,4702–4710.
• Truyen, U., Evermann, J.F., Vieler, E., Parrish, C.R., 1996. Evolutionof canine parvovirus involved loss and gain of feline hostrange. Virology 215, 186–189.
• Vihinen-Ranta, M., Kalela, A., Makinen, P., Kakkola, L., Marjomaki,V., Vuento, V., 1998. Intracellular route of canine parvovirusentry. J. Virol. 72, 802–806.
• Wang, H.C., Chen,W.D., Lin, S.L., Chan, J.P.W.,Wong, M.L., 2005.Phylogenetic analysis of canine parvovirus VP2 gene in Taiwan.Virus Genes 31, 171–174.